導(dǎo)  讀

本案例搭建與驗(yàn)證萬古霉素在大鼠與人體的PBPK模型，并基于模型預(yù)測藥物在腎臟及腎小管中的濃度變化；并在推測腎臟組織濃度的基礎(chǔ)上，設(shè)定體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察萬古霉素的濃度變化對腎臟細(xì)胞的毒性；最后鑒定出一系列可作為生物標(biāo)記物的溶血磷脂，其體內(nèi)的釋放與萬古霉素的濃度具有明顯的濃度依賴性。總之，案例聯(lián)合機(jī)制性PBPK模型和體外代謝組學(xué)以深入解釋萬古霉素引發(fā)腎毒性的體內(nèi)外關(guān)系；此外該案例對于學(xué)習(xí)基于PBPK模型的種屬外推(預(yù)測PK)、由血漿PK推測組織濃度變化、膜限速組織藥物的PBPK建模都具有參考意義。

原文獻(xiàn)作者

Haiyan Du1, Zheng Li2, Yi Yang3, Xiao Li1, Yongxiang Wei4, Yang Lin1, Xiaomei Zhuang2

杜海燕1, 李正2, 楊毅3, 李驍1, 魏永祥4, 林陽1, 莊笑梅2

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，藥事部

2軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

3首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，心臟外科危重癥中心

4首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京安貞醫(yī)院，耳鼻咽喉頭頸外科中心

參考文獻(xiàn)

Haiyan Du, Zheng Li, Yi Yang, et al., New insights into the vancomycin-induced nephrotoxicity using in vitro metabolomics combined with physiologically based pharmacokinetic modeling. J Appl Toxicol. 2020: 1–11.  IF: 3.065

推薦理由

本案例搭建與驗(yàn)證萬古霉素在大鼠與人體的PBPK模型，并基于模型預(yù)測藥物在腎臟及腎小管中的濃度變化；并在推測腎臟組織濃度的基礎(chǔ)上，設(shè)定體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)考察萬古霉素的濃度變化對腎臟細(xì)胞的毒性；最后鑒定出一系列可作為生物標(biāo)記物的溶血磷脂，其體內(nèi)的釋放與萬古霉素的濃度具有明顯的濃度依賴性。總之，案例聯(lián)合機(jī)制性PBPK模型和體外代謝組學(xué)以深入解釋萬古霉素引發(fā)腎毒性的體內(nèi)外關(guān)系；此外該案例對于學(xué)習(xí)基于PBPK模型的種屬外推(預(yù)測PK)、由血漿PK推測組織濃度變化、膜限速組織藥物的PBPK建模都具有參考意義。

案例摘要

目的：通過生理藥代動力學(xué)(PBPK)的建模與模擬，研究萬古霉素在人體腎小管及腎臟中的濃度。在研究腎小管中萬古霉素暴露量的基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)和體外代謝組學(xué)分析，考察萬古霉素在人腎臟近端小管上皮細(xì)胞中的毒性。

所建立的大鼠PBPK模型預(yù)測結(jié)果和觀測值基本吻合，預(yù)測萬古霉素在腎小管中的濃度是血漿的40-50倍；進(jìn)一步將該模型外推到人體，預(yù)測人體每6小時(shí)給藥500 mg后在腎小管中的濃度范圍為316.1-2136.6 μg/mL、每12小時(shí)給藥1000 mg后的濃度范圍為199.0-3932.5 μg/mL。4 mg/mL 萬古霉素的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)也表明其有顯著的腎毒性。通過代謝組學(xué)發(fā)現(xiàn)了11種溶血磷脂酰膽堿和1種溶血磷脂酰乙醇胺，且溶血磷脂的釋放與萬古霉素 24小時(shí)的治療濃度(0.125-4 mg/mL)具有明顯的濃度依賴性。該研究通過機(jī)制性PBPK模型講述了萬古霉素在腎臟中的暴露與其臨床用藥濃度下的腎毒性之間的關(guān)系；并鑒定出一系列可作為潛在生物標(biāo)記物的溶血磷脂。

軟件用途

該案例，利用GastroPlus軟件搭建了萬古霉素在大鼠及人體的PBPK模型，預(yù)測并驗(yàn)證了藥物在血漿、腎臟、腎小管中的PK曲線；且可以推測給藥劑量、受試者人群(健康人到病人等)等信息變化后，藥物在人體內(nèi)血漿及組織中的濃度隨時(shí)間的變化。基于所預(yù)測的組織濃度，進(jìn)一步分析與體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、代謝組學(xué)鑒定潛在的生物標(biāo)記物等數(shù)據(jù)間體內(nèi)外關(guān)系，以深入理解萬古霉素腎毒性的機(jī)理以及體外潛在標(biāo)記物。 此外，GastroPlus軟件還用于準(zhǔn)確捕獲萬古霉素這類組織細(xì)胞膜限速型擴(kuò)散的分布過程。

1. 研究背景

萬古霉素（vancomycin）是治療多藥耐藥性革蘭氏陽性菌引起的侵襲性感染的一線藥物，但是由其引發(fā)的腎毒性卻日益增加，特別是復(fù)雜危重的病人。當(dāng)前，未能很好地闡述萬古霉素引起的腎毒性與其作用部位的暴露量之間的聯(lián)系。盡管先前的一些研究透露了腎小管細(xì)胞的促炎性氧化、線粒體功能障礙和細(xì)胞凋亡涉及萬古霉素引發(fā)的急性腎損傷(AKI)，但是依然不清楚腎毒性的真正機(jī)理。此外，臨床用藥中也很少有敏感、可靠的生物標(biāo)記物以指示萬古霉素的腎毒性；常規(guī)的方式建議監(jiān)測萬古霉素的谷濃度以確保患者的用藥安全，但這并沒有顯著改善萬古霉素臨床腎毒性與死亡率的發(fā)生。

一些研究建立在組織解剖學(xué)的基礎(chǔ)上，指出萬古霉素臨床劑量下的暴露與其發(fā)生急性腎損傷AKI的相互關(guān)系。雖然這些研究暫未被充分認(rèn)定，但組織暴露還是認(rèn)為藥物產(chǎn)生藥效及毒性的重要環(huán)節(jié)，因?yàn)橥ǔＫ幮Ъ岸拘园袠?biāo)很少位于血漿中。可是，臨床中很難測定人體的組織濃度變化。生理藥代動力學(xué)(PBPK)模型由機(jī)體的不同組織器官，并連接機(jī)體血液循環(huán)構(gòu)建起來。PBPK模型可以機(jī)制性地闡述一個(gè)化合物的處置過程，現(xiàn)已廣泛地用于預(yù)測人體PK和藥物藥物相互作用，此外還能夠很好地描述組織處置特征。

該工作的目的是為了揭示萬古霉素腎毒性的特性與其在腎小管中濃度之間的關(guān)系。首先搭建了大鼠的PBPK模型，以探索萬古霉素在腎小管中的暴露與血漿濃度間的關(guān)系；然后將大鼠PBPK模型外推到健康人體，以預(yù)測腎小管中的萬古霉素濃度；最后通過監(jiān)測的血漿谷濃度數(shù)據(jù)，對ICU中中等到重度腎損傷病人的PBPK模型進(jìn)行了驗(yàn)證。基于PBPK模型推測的腎小管濃度水平，在腎臟近端小官上皮細(xì)胞株(HKCs)開展體外毒性評估以及代謝組學(xué)分析；從而進(jìn)一步探索萬古霉素引發(fā)的腎毒性機(jī)理以及表征腎毒性的生物標(biāo)記物。

2. 建模數(shù)據(jù)與處理

2.1 萬古霉素的相關(guān)建模參數(shù)

萬古霉素基礎(chǔ)PBPK模型輸入的理化性質(zhì)參數(shù)，表1

2.2 數(shù)據(jù)獲取及處理

為了預(yù)測萬古霉素的PK曲線及組織分布，整個(gè)PBPK模型分為以下四個(gè)步驟：(a)構(gòu)建大鼠PK及組織分布的基礎(chǔ)PBPK模型；(b)將大鼠PBPK模型外推到人體，以預(yù)測和驗(yàn)證萬古霉素在美國年輕人血漿PK和尿液排泄行為；(c)采用GastroPlus內(nèi)建的美國健康成人在不同劑量、多次給藥，以及心外科手術(shù)后伴隨腎功能損傷病人的PK行為對模型進(jìn)一步驗(yàn)證；(d)預(yù)測臨床監(jiān)測中無法獲得的健康人或腎損病人的腎臟及腎小管中萬古霉素分布。

由于萬古霉素經(jīng)常是以靜脈(iv)的形式給藥，因此組織分布和藥物清除的表征是搭建該藥物PBPK模型的兩個(gè)重要環(huán)節(jié)。萬古霉素具有中等脂溶性、分子體積大以及眾多非離子基團(tuán)，因此預(yù)期萬古霉素的組織分布是膜限速的特征，其中細(xì)胞膜滲透能力與表面積的乘積(PStc)是該表征該類型組織分布的一個(gè)重要參數(shù)。案例假設(shè)不同組織器官的細(xì)胞膜組成是相近的，通過大鼠觀測的血漿及腎臟暴露優(yōu)化得到特定的PStc數(shù)據(jù)為4 × 10?5 mL/s/mL cell volume，并用此參數(shù)轉(zhuǎn)化計(jì)算每個(gè)組織實(shí)際的PStc；

已經(jīng)有大量研究表明萬古霉素主要經(jīng)腎臟排泄的方式清除：總清除的90%為腎臟原型排泄，剩下10%大概為肝臟代謝清除。模型中通過血漿游離藥物分?jǐn)?shù)(fup)與腎小球?yàn)V過率(GFR)的乘積定義萬古霉素的腎臟清除；也加入10%的腎臟清除作為肝臟代謝清除率；除此之外，沒有納入其它的清除機(jī)制。模型中未考慮主動轉(zhuǎn)運(yùn)，僅考慮腎小球?yàn)V過及細(xì)胞膜簡單被動擴(kuò)散對萬古霉素組織分布及腎臟清除的貢獻(xiàn)；

按照大鼠相似的特性進(jìn)行設(shè)置并選擇相同的膜限速組織以及PStc數(shù)值，外推至人體PBPK模型，以預(yù)測單劑量和多劑量給藥后萬古霉素在人體血漿、腎臟和腎小管中的濃度變化。模型也進(jìn)一步采用臨床心外科手術(shù)后患者給藥后的血漿谷濃度數(shù)據(jù)進(jìn)行驗(yàn)證，并預(yù)測患者腎臟及腎小管中的濃度。以急性腎損傷AKI指標(biāo)劃分的臨床患者，提示其腎功能可能已經(jīng)變得很差，因此患者模型中選擇了GastroPlus內(nèi)建不同等級的腎損傷病人(因?yàn)檐浖壳爸饕訥FR的降低來劃分不同程度的腎損)。

2.3 細(xì)胞毒性的分析

在預(yù)測得到多次給藥后，萬古霉素在腎小管中的分布及濃度變化基礎(chǔ)行，設(shè)計(jì)了一系列濃度范圍的萬古霉素以考察其對腎臟近端小官上皮細(xì)胞株HKCs的毒性。在不同濃度萬古霉素或陰性對照暴露于腎臟近端小官上皮細(xì)胞株HKCs體系24小時(shí)后，采用XTT試劑盒評估細(xì)胞的活性，以考察萬古霉素對HKCs的毒性特征。

2.4 代謝組學(xué)分析

為了發(fā)現(xiàn)特異性的代謝產(chǎn)物以用作表征萬古霉素引發(fā)腎毒性的選擇性和敏感性的生物標(biāo)記物，進(jìn)一步研究了細(xì)胞培養(yǎng)液的代謝曲線；在上述細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)的上清液中進(jìn)行了代謝組學(xué)的分析。

3. 模型結(jié)果與分析

3.1 大鼠PBPK模型的搭建與驗(yàn)證

基于膜限速型組織的假設(shè)，并通過匹配大鼠血漿及腎臟的濃度-時(shí)間曲線優(yōu)化了PStc數(shù)值。預(yù)測得到的大鼠單劑量10 mg/Kg給藥后的PK曲線與觀測結(jié)果較為一致，血漿AUC的數(shù)值與觀測結(jié)果的誤差(P/O)控制在1.5倍以內(nèi)，預(yù)測結(jié)果如下圖：

單劑量10 mg/Kg靜脈推注給藥后，大鼠實(shí)測及PBPK模型預(yù)測的濃度-時(shí)間曲線圖(深藍(lán)色方塊點(diǎn)與連續(xù)曲線表示大鼠血漿觀測及預(yù)測的血漿濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)；綠色方塊點(diǎn)與連續(xù)曲線表示大鼠腎臟觀測及預(yù)測的濃度-時(shí)間數(shù)據(jù))

3.2 萬古霉素種屬外推及人體PK預(yù)測

將大鼠的PBPK模型外推到人，預(yù)測美國年輕人單劑量給藥后的濃度變化，以及美國成人多次給藥(不同劑量)后的PK曲線，結(jié)果見下圖所示，相關(guān)的PK參數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見下表。模擬的人體血漿PK參數(shù)與觀測值相比也在誤差允許范圍內(nèi)(0.7-1.5)。此外，單劑量給藥后的美國年輕人還采集了尿液排泄數(shù)據(jù)，從模型中可以看到預(yù)測的尿液排泄曲線能夠很好地吻合觀測數(shù)據(jù)(P/O=0.99)。PK參數(shù)統(tǒng)計(jì)表中的數(shù)據(jù)顯示PK參數(shù)的P/O位于0.79-1.05之間，說明建立的PBPK模型能夠很準(zhǔn)確地預(yù)測萬古霉素多次給藥后血漿中濃度-時(shí)間的變化(該劑量方案也常用在臨床實(shí)踐中)。此外，建立和評估了該模型對中國人給藥后的預(yù)測能力，統(tǒng)計(jì)結(jié)果也依然表明P/O在可接受的范圍內(nèi)。

單劑量1000 mg靜脈滴注給藥后，美國年輕人實(shí)測及PBPK模型預(yù)測的濃度-時(shí)間曲線圖(深藍(lán)色方塊點(diǎn)與連續(xù)曲線表示人體血漿觀測及預(yù)測的血漿濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)；綠色方塊點(diǎn)與連續(xù)曲線表示人累積尿排泄的觀測及預(yù)測的萬古霉素含量-時(shí)間數(shù)據(jù))

多劑量靜脈滴注給藥后，美國成人實(shí)測及PBPK模型預(yù)測的血漿、腎臟、腎小管濃度-時(shí)間曲線圖(深藍(lán)色、淺藍(lán)色及綠色連續(xù)曲線分別表示預(yù)測的人體血漿、腎臟和腎小管平均濃度-時(shí)間曲線；深藍(lán)色方塊點(diǎn)表示實(shí)測的血漿萬古霉素平均濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)點(diǎn)；A圖為每12小時(shí)給藥1000 mg的給藥方案、B圖為每6小時(shí)給藥500 mg的給藥方案)

表2 美國人單劑量及多劑量靜脈滴注給藥后，PBPK模型預(yù)測與臨床觀測的PK參數(shù)對比

注：AUC-PK曲線下的面積；P/O-預(yù)測與觀測PK參數(shù)的比值

表3 中國人單劑量靜脈給藥后，PBPK模型預(yù)測與臨床觀測的PK參數(shù)對比

3.3 萬古霉素在病人的PBPK模型

下圖為心外科手術(shù)后腎功能改變的臨床病人靜脈給藥萬古霉素的預(yù)測結(jié)果與觀測值，結(jié)果顯示兩者較為吻合。和正常人體相比，腎功能損傷患者的萬古霉素 PK特征為：(a) 腎臟Tmax沒有很明顯的延長；(b)腎小管及腎臟中的萬古霉素濃度都有上升；(c) 萬古霉素在靶部位的濃度范圍愈加變窄(腎小管：380.92-1446.21 μg/mL vs. 199.04-3932.52 μg/mL)；(d)當(dāng)患者的腎功能損傷從中度變成重度時(shí)，萬古霉素在腎小管及腎臟中的量及濃度都進(jìn)一步降低。

多劑量靜脈滴注給藥后，心外科手術(shù)后腎功能改變的患者實(shí)測及PBPK模型預(yù)測的血漿、腎臟、腎小管濃度-時(shí)間曲線圖(深藍(lán)色、淺藍(lán)色及綠色連續(xù)曲線分別表示預(yù)測的人體血漿、腎臟和腎小管平均濃度-時(shí)間曲線；深藍(lán)色方塊點(diǎn)表示實(shí)測的血漿萬古霉素谷濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)點(diǎn))

3.4 細(xì)胞活性

該工作特別研究了在相對臨床濃度下，萬古霉素對腎臟近端小官上皮細(xì)胞株HKCs的活性影響。基于PBPK模型預(yù)測多劑量給藥后，萬古霉素在組織(特別是腎小管)的分布特性，設(shè)計(jì)了一系列濃度(0.125, 0.25, 0.5, 1, 2和4 mg/mL)的萬古霉素，并考察對HKCs的影響。發(fā)現(xiàn)孵育24小時(shí)后，萬古霉素濃度小于2 mg/mL時(shí)，其對HKCs的細(xì)胞毒性不明顯；但是當(dāng)濃度達(dá)到4 mg/mL時(shí)，萬古霉素對細(xì)胞生長的抑制率達(dá)到16.5%，具有明顯的細(xì)胞毒性。

3.5 鑒定可預(yù)測萬古霉素引發(fā)腎毒性的生物標(biāo)記物

通過研究，總共發(fā)現(xiàn)了12種可明顯指示萬古霉素引發(fā)腎小管功能改變的代謝產(chǎn)物，包括11種溶血磷脂酰膽堿和1種溶血磷脂酰乙醇胺，且溶血磷脂的釋放量與萬古霉素24小時(shí)的治療濃度(0.125-4 mg/mL)具有明顯的濃度依賴性。這些劑量依賴性的潛在生物標(biāo)記物可用作反映萬古霉素引發(fā)腎毒性的程度。

4. 模型討論

對于毒理學(xué)的研究，發(fā)現(xiàn)藥物暴露與毒副作用之間的關(guān)系非常重要，其中靶組織中的暴露水平是一個(gè)重要因素；但是獲取臨床患者靶組織的真實(shí)濃度幾乎不可能的。因此本研究期望通過建立PBPK模型，以預(yù)測萬古霉素在健康成人及ICU患者腎臟、腎小管中的分布。

基于推測的萬古霉素腎臟毒性的機(jī)制主要是其導(dǎo)致腎臟近端小管功能紊亂，確定藥物在腎小管中的暴露至關(guān)重要。借助建立的PBPK模型，可以發(fā)現(xiàn)萬古霉素在腎小管和腎臟中的濃度要遠(yuǎn)高于血漿中的濃度。腎小管中的萬古霉素濃度變化與血漿較為相似，但是暴露量約為血漿的40倍。但是萬古霉素在腎臟中的分布與血漿有較大的差異，表現(xiàn)峰濃度的達(dá)峰時(shí)間滯后，藥物的消除速率要遠(yuǎn)慢于血漿和腎小管；總的暴露量約是血漿的20倍。對比美國人的兩種給藥方案，可以很容易發(fā)現(xiàn)每6小時(shí)給藥500 mg后血漿、腎臟及腎小管的萬古霉素濃度范圍(腎小管：316.11-2136.61 μg/mL)較每12小時(shí)給藥1000 mg (腎小管：199.04-3932.52 μg/mL)要窄，但是血漿的谷濃度并沒有明顯的差異(監(jiān)測血漿谷濃度可能并不能規(guī)避萬古霉素的腎毒性)。對于臨床患者的PBPK模型來說，發(fā)現(xiàn)萬古霉素在靶部位的濃度范圍愈加變窄(腎小管：380.92-1446.21 μg/mL vs. 199.04-3932.52 μg/mL)；當(dāng)患者的腎功能損傷從中度變成重度時(shí)，萬古霉素在腎小管及腎臟中的量及濃度都進(jìn)一步降低。

建立在PBPK模型預(yù)測腎小管中萬古霉素暴露水平的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了萬古霉素對腎臟近端小官上皮細(xì)胞株HKCs細(xì)胞活性的影響(該工作采用模型預(yù)測的腎小管中萬古霉素濃度：0.125-4 mg/mL )。研究結(jié)果提示較高濃度(4 mg/mL)的萬古霉素對HKCs有明顯的細(xì)胞毒性，這透露臨床中萬古霉素按照每6小時(shí)給藥500 mg的安全性要好于每12小時(shí)給藥1000 mg。

為了深入探尋萬古霉素引發(fā)腎毒性的潛在生物標(biāo)記物，該工作還進(jìn)一步對萬古霉素處理的腎臟近端小官上皮細(xì)胞株HKCs培養(yǎng)液進(jìn)行了代謝組學(xué)的分析。本研究首次發(fā)現(xiàn)了一些溶血磷脂(大部分是溶血磷脂酰膽堿lysoPCs)的相對豐度與腎小管中的萬古霉素具有明顯的劑量依賴性。

5. 總結(jié)

該工作通過GastroPlus軟件的PBPK建模，表明萬古霉素引發(fā)的腎毒性主要由于其在腎臟及腎小管(最為主要)中的大量分布，從而導(dǎo)致了腎臟近端小管功能紊亂。該結(jié)果也進(jìn)一步通過體外腎臟近端小官上皮細(xì)胞株HKCs毒性實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)，并鑒定出可反映萬古霉素臨床給藥后腎毒性的潛在生物標(biāo)記物，以便更準(zhǔn)確地提示臨床給藥后是否會引起患者的腎臟毒性。通過此細(xì)致的研究，表明PBPK模型對于處理靶部位暴露與響應(yīng)之間的聯(lián)系是一個(gè)非常有用的工具，它可以用于推測組織中藥物濃度-時(shí)間曲線，以及深入研究靶器官的機(jī)理過程。

6. 應(yīng)用軟件與模塊

該案例應(yīng)用的軟件是GastroPlus (version 9.6)，涉及模塊有Base, PBPK, PKPlus, ADMET Predictor。

參考文獻(xiàn)

Haiyan Du, Zheng Li, Yi Yang, et al., New insights into the vancomycin-induced nephrotoxicity using in vitro metabolomics combined with physiologically based pharmacokinetic modeling. J Appl Toxicol. 2020: 1–11.  IF: 3.065